Bakteri Sütü: Hassas Fermantasyonun Arkasındaki Genetik Mühendisliği

Metnin analizini dinlemek için aşağıdaki oynatıcıyı kullanabilirsiniz.

BÖLÜM 1: GİRİŞ VE KAVRAMSAL ÇERÇEVE

Biyoteknoloji, gıda üretim sistemlerini yeniden tanımlama potansiyeline sahip yeni bir teknolojik paradigmaya tanıklık etmektedir. Geleneksel hayvansal tarıma dayalı gıda üretimi, artan küresel protein talebini karşılarken, sürdürülebilirlik, iklim değişikliği üzerindeki etkiler, arazi kullanımı ve hayvan refahı konularında önemli zorluklarla karşı karşıyadır.¹ Bu zorluklar, “gerçek” hayvansal proteinleri, spesifik olarak süt proteinlerini (kazein ve peynir altı suyu) hayvanlara (örn. inekler) ihtiyaç duymadan üretebilen alternatif yöntemlere yönelik yoğun bir bilimsel araştırmayı tetiklemiştir.

Kullanıcı sorgusunda “bakteri sütü” olarak kavramsallaştırılan bu yaklaşım, genetik mühendisliği ve mikrobiyal fermantasyonun kesişim noktasında yer almaktadır. Temel prensip, memeli süt bezlerinde süt proteinlerini kodlayan genetik bilgiyi alıp, bu bilgiyi hızla büyüyen ve kolayca manipüle edilebilen mikroorganizmalara (bakteri veya maya gibi) aktarmaktır. Bu genetik olarak programlanmış mikroplar, daha sonra endüstriyel biyoreaktörlerde, esasen “hücre fabrikaları” olarak işlev görerek, geleneksel fermantasyona benzer bir süreçle bu hedef proteinleri sentezler ve salgılar.¹

1.1 Terminoloji ve Bilimsel Tanım: Hassas Fermantasyon ve Hücresiz Tarım

Bu teknolojik alanı doğru bir şekilde sınıflandırmak için akademik terminolojiyi netleştirmek elzemdir. Kullanılan süreç, genellikle “hassas fermantasyon” (precision fermentation) olarak adlandırılır. Hassas fermantasyon, mikroorganizmaları belirli, yüksek değerli fonksiyonel bileşikleri (proteinler, enzimler, yağlar veya vitaminler gibi) üretmek üzere genetik olarak programlama sürecini tanımlar.¹ Bu, bira veya yoğurt üretiminde kullanılan geleneksel fermantasyondan (mikroorganizmanın kendisinin veya basit metabolitlerinin ürün olduğu) veya mikroorganizmanın kendi kütlesinin (biyokütle) birincil ürün olduğu (örn. mikoprotein) biyokütle fermantasyonundan farklıdır.

Hassas fermantasyon, daha geniş bir şemsiye terim olan “hücresel tarım” (cellular agriculture) alanı içinde yer alır. Hücresel tarım, tarımsal ürünlerin geleneksel çiftçilik yerine hücre kültürlerinden üretilmesini kapsar.⁵ Bu alan iki ana dala ayrılır:

1. Hücresel (Cellular) Tarım: Hayvanlardan alınan kök hücrelerin çoğaltılmasıyla kas ve yağ gibi yapılandırılmış dokuların (örn. kültür eti) üretilmesine odaklanır.⁵
2. Hücresiz (Acellular) Tarım: Mikroorganizmalar (maya, bakteri, mantar) kullanılarak proteinler (kazein, peynir altı suyu, yumurta akı) veya yağlar gibi spesifik moleküllerin üretilmesine odaklanır. Bu ürünler “hücresiz” olarak adlandırılır çünkü nihai saflaştırılmış protein ürünü, onu üreten genetiği değiştirilmiş mikroorganizmanın (GDO) kendisini içermez.⁵

Bu nedenle, rekombinant süt proteinlerinin üretimi, “hücresiz tarım” alanı içinde “hassas fermantasyon” teknolojisi kullanılarak gerçekleştirilen bir süreçtir.

1.2 Bilimsel Motivasyon: Geleneksel Üretimin Sürdürülebilirlik Sorunları

Bu alandaki araştırmaların birincil itici gücü, mevcut gıda sistemlerinin, özellikle de ruminant (geviş getiren) hayvancılığının çevresel sürdürülemezliğidir.¹ Geleneksel süt hayvancılığı, küresel sera gazı emisyonlarının, arazi kullanımının (toplam tarım arazisinin yaklaşık %40’ı sadece yem ve mera için kullanılmaktadır ⁹) ve su tüketiminin önemli bir bölümünden sorumludur.

Artan küresel nüfusun protein talebini (2050 yılına kadar mevcut seviyelerden %80 daha fazla protein üretimi gerekebilir ⁹) karşılama zorunluluğu, geleneksel yöntemlerin ölçeklenebilirliği konusunda ciddi soru işaretleri yaratmaktadır. Hassas fermantasyon, bu talebi karşılarken aynı zamanda çevresel kaygıları ¹, gıda güvenliğini (hayvan kaynaklı patojen risklerinin azaltılması) ve hayvan refahı ¹ ile ilgili etik sorunları ele alma potansiyeli sunar.¹⁰

Ayrıca, bu teknoloji, iklimsel veya coğrafi kısıtlamalar nedeniyle sığır yetiştirmenin pratik, ekonomik veya mümkün olmadığı kuzey ve uzak bölgeler gibi yerlerde yerel gıda üretimi için yeni olanaklar yaratma potansiyeline sahiptir.⁶ Bu, gıda egemenliğini ve tedarik zinciri direncini artırabilir.

1.3 Raporun Kapsamı ve Hedefleri

Kullanıcı talebi doğrultusunda bu teknik inceleme, rekombinant süt proteinleri üretiminin ticari yönlerine (şirket isimleri, pazar analizleri) veya tüketici algısı ve kabulü ¹¹ gibi sosyolojik boyutlarına odaklanmayacaktır. Raporun kapsamı, bu teknolojinin altında yatan temel bilimsel ve teknik zorluklarla kesinlikle sınırlandırılmıştır.

Odak noktası, bu proteinlerin mikrobiyal sistemlerde de novo sentezlenmesini mümkün kılan temel disiplinlerin derinlemesine incelenmesidir:

1. Genetik Mühendisliği ve Sentetik Biyoloji: Süt proteini genlerinin mikrobiyal konaklara nasıl aktarıldığı, optimize edildiği ve ifade edildiği.
2. Mikrobiyal Konak Sistemleri: Bakteri (E. coli gibi) ve maya (P. pastoris gibi) sistemlerinin bu görev için sunduğu avantajlar, dezavantajlar ve teknik sınırlılıklar.
3. Biyokimyasal Zorluklar: Süt proteinlerinin, özellikle kazeinin, doğal yapılarını ve fonksiyonlarını (örn. fosforilasyon) kopyalamadaki zorluklar.
4. Proses Mühendisliği: Proteinlerin üretildiği biyoreaktör süreçleri ve saflaştırma (downstream processing) aşamalarındaki engeller.

Bu inceleme, rekombinant insülin senteziyle bir metodolojik karşılaştırma yaparak başlayacak ve ardından peynir altı suyu (whey) proteinlerinin üretimindeki (görece) basitlikten, kazein misellerinin yeniden yapılandırılmasının (reconstruction) oluşturduğu muazzam bilimsel sınıra (scientific frontier) doğru ilerleyecektir.⁴

BÖLÜM 2: REKOMBİNANT PROTEİN ÜRETİMİNDE PARADİGMA: İNSÜLİNDEN SÜT PROTEİNİNE GEÇİŞ

Süt proteinlerinin mikrobiyal sentezi, izole bir teknolojik atılım değil, on yıllardır süregelen rekombinant DNA teknolojisi devriminin en son uygulamasıdır. Bu alanın metodolojik temellerini ve mevcut zorluklarını anlamak için, hassas fermantasyonun ilk ve en belirgin başarısı olan rekombinant insan insülininin üretimine bakmak zorunludur.

2.1 Tarihsel ve Metodolojik Emsal: Rekombinant İnsan İnsülini

Genetik mühendisliğinin doğuşu, 1972’de Paul Berg’in ilk rekombinant DNA molekülünü (SV40 maymun virüsü DNA’sını lambda virüsü ile birleştirerek) yaratmasıyla ve 1973’te Herbert Boyer ve Stanley Cohen’in bu teknolojiyi kullanarak ilk genetiği değiştirilmiş organizmayı (GDO) (bir bakteri) üretmesiyle işaretlenir.¹⁷ Bu öncü çalışmalar ¹⁸, genlerin türler arasında aktarılmasının önünü açmıştır.

Bu teknolojinin ilk büyük ölçekli uygulaması farmasötik alanda gerçekleşti. 1978’de, insan insülini genleri klonlandı ve Escherichia coli (E. coli) bakterisi içinde ifade edildi.¹⁷ 1982’de, bu teknolojiyle üretilen rekombinant insan insülini, diyabet tedavisi için lisanslanan ilk biyoteknoloji ilacı oldu.¹⁸

Metodolojik olarak bu, hassas fermantasyonun ilk örneğiydi.²⁰ İlk yaklaşımlar, insülin proteinini oluşturan A ve B polipeptit zincirlerinin cDNA’larını (tamamlayıcı DNA) ayrı ayrı sentezlemeyi, bunları iki farklı E. coli suşunda ifade etmeyi, zincirleri saflaştırmayı ve ardından in vitro (hücre dışında) kimyasal yollarla birleştirerek biyolojik olarak aktif insülini oluşturmayı içeriyordu.¹⁸

Ancak, çok daha verimli ve kullanışlı bir yöntem hızla geliştirildi. Bu yöntemde, insülinin öncül formu olan “proinsülin”i kodlayan tek bir cDNA, E. coli‘de ifade edildi. Proinsülin saflaştırıldıktan sonra, C-peptit olarak bilinen ara bağlantı parçası, tripsin ve karboksipeptidaz gibi enzimlerle proteolitik olarak kesildi. Bu işlem, A ve B zincirlerinin doğru şekilde katlanmış ve disülfit bağlarıyla bağlanmış halde kalmasını sağlayarak tam fonksiyonel insülini açığa çıkardı. Bu proinsülin yöntemi, 1986’dan beri ticari olarak büyük ölçekli üretim için standart haline gelmiştir.¹⁸

İnsülinin (ve daha sonra gıda endüstrisinde peynir yapımı için hayvansal şirden yerine kullanılan kimozin enziminin ¹⁹) başarısı, mikropların karmaşık memeli proteinlerini üretmek üzere güvenli ve verimli “hücre fabrikaları” olarak programlanabileceğini kanıtladı.

2.2 Temel Paradigma Farklılığı: Farmasötik ve Gıda Proteinleri Arasındaki Ekonomik ve Teknik Uçurum

Kullanıcının belirttiği insülin analojisi, temel genetik mühendisliği prensibi (bir memeli genini bir mikroba yerleştirmek) açısından metodolojik olarak doğru olsa da, gıda proteinleri uygulaması söz konusu olduğunda ekonomik ve ölçeklendirme açısından yanıltıcıdır. Bu fark, süt proteinlerinin mikrobiyal sentezinin karşı karşıya olduğu temel bilimsel ve mühendislik zorluğunun kalbini oluşturur.

Farmasötik proteinler (insülin, antikorlar, büyüme hormonları) son derece yüksek değerli, ancak buna karşılık düşük hacimli ürünlerdir. Bu ürünler için (örn. kilogram başına milyarlarca dolar), üretim maliyetinin önemli bir kısmı Ar-Ge, klinik deneyler ve pazarlamaya giderken, üretim verimliliği (titre) maliyetin birincil belirleyicisi değildir.²³ Farmasötik üretimde en yüksek öncelik saflık ve biyolojik aktivitedir; üretim titresi düşük olsa bile (örn. 1 g/L), ürünün yüksek satış fiyatı bunu telafi eder.

Buna karşılık, süt proteinleri (kazein, peynir altı suyu) düşük değerli, son derece yüksek hacimli (emtia) bileşenlerdir. Geleneksel süt endüstrisi ile maliyet açısından rekabet edebilmek için, bu proteinlerin muazzam miktarlarda ve son derece düşük maliyetle üretilmesi gerekir.⁹

Bu ekonomik zorunluluk, temel bir teknik hedefi belirler: üretim titresi (biyoreaktördeki kültür sıvısının hacmi başına üretilen protein miktarı). Süt ve yumurta proteinlerinin hassas fermantasyon yoluyla ticari olarak uygulanabilir olması için hedeflenen üretim titresinin $50 \text{ g/L}$’den (litre başına 50 gram) fazla olması gerektiği öngörülmektedir.²

Bu $50 \text{ g/L}$ hedefi, farmasötik protein üretiminde tipik olarak gerekli olan titrelerden “birkaç kat büyüklük” (several orders of magnitude) daha yüksektir.² Bu, bilimsel paradigmayı temelden değiştirir. Sorun artık “Bu proteini üretebilir miyiz?” (insülinde olduğu gibi) değil, “Bu proteini inanılmaz derecede yüksek verimlilikte, düşük maliyetli hammaddeler kullanarak ve sürekli bir şekilde üretebilir miyiz?” haline gelmiştir.

Bu muazzam verimlilik gereksinimi nedeniyle, rekombinant süt proteini araştırmalarında üç alan “kritik başarı faktörleri” olarak öne çıkmaktadır ²:

1. Suş Mühendisliği (Strain Engineering): Mikroorganizmanın genetiğini, protein üretimini en üst düzeye çıkarmak için (örn. daha güçlü promotörler, optimize edilmiş metabolik yollar) ince ayar yapmak.
2. Proses Optimizasyonu (Process Optimization): Biyoreaktördeki koşulları (sıcaklık, pH, besin beslemesi) titreyi maksimize etmek için hassas bir şekilde kontrol etmek.
3. Ölçeklendirme (Scale-up): Laboratuvar ölçeğindeki (örn. 1 litrelik) başarıyı, endüstriyel ölçekteki (örn. 100.000 litrelik) biyoreaktörlere taşımak.

Bu nedenle, “bakteri sütü” alanı, saf biyolojiden ziyade biyoteknoloji, (kimya) proses mühendisliği ve sürdürülebilir gıda üretiminin entegre olduğu yeni bir araştırma yönünü tanımlamaktadır.²

BÖLÜM 3: MİKROBİYAL KONAK SİSTEMLER: SÜT PROTEİNİ SENTEZİ İÇİN “HÜCRE FABRİKALARI”

Süt proteinlerinin $>50 \text{ g/L}$ gibi hedeflenen yüksek titrelerde üretilmesi, bu görevi yerine getirmek üzere tasarlanmış “hücre fabrikaları”nın, yani mikrobiyal konak sistemlerinin seçimine ve mühendisliğine bağlıdır. Seçilen konak (bakteri veya maya), üretim sürecinin verimliliğini, maliyetini ve en önemlisi nihai proteinin işlevselliğini doğrudan belirler.

3.1 Genetik Mühendisliği Temelleri: Genin Konak Hücreye Aktarılması

Hangi konak kullanılırsa kullanılsın, temel süreç, hedeflenen süt proteinini (örn. bovin $\beta$-laktoglobulin veya $\alpha_{s1}$-kazein) kodlayan genetik talimatların ¹⁴ konak hücreye aktarılmasını içerir.

Bu süreç, standart rekombinant DNA teknolojisi adımlarıyla başlar. İlk olarak, hedef proteinin gen dizisi (genomik veya cDNA) ²⁴, genellikle Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) adı verilen bir teknik kullanılarak in vitro olarak çoğaltılır.²⁵ Bu çoğaltılmış gen, daha sonra “plazmid vektör” adı verilen dairesel bir DNA molekülüne (taşıyıcı) eklenir. Bu rekombinant plazmid, daha sonra E. coli gibi bir konak organizmaya aktarılır (transformasyon).¹⁷ E. coli hızla çoğaldıkça, plazmidi ve dolayısıyla hedef geni de kopyalar.

Modern sentetik biyoloji yaklaşımları, bu sürecin çok daha ötesine geçer. Sadece geni kopyalamak yerine, onu konak mikroorganizma için optimize ederler:

• Kodon Optimizasyonu: Proteinler amino asit dizileridir ve her amino asit “kodon” adı verilen üç nükleotitlik DNA dizileriyle kodlanır. Farklı organizmalar, aynı amino asit için farklı kodonları tercih eder (kodon yanlılığı – codon bias ²⁶). Sentetik biyoloji, sığır genindeki kodonları, mayanın veya bakterinin en verimli şekilde “okuyabileceği” kodonlarla değiştirerek protein ifadesini (transkripsiyon seviyesini) ²⁷ en üst düzeye çıkarır.
• Promotör Mühendisliği: Promotörler, bir genin “açma/kapama” anahtarlarıdır. Araştırmacılar, konak organizmanın en güçlü promotörlerini (örn. P. pastoris‘teki AOX1 promotörü) hedef genin önüne yerleştirerek, hücrenin kaynaklarının büyük bir kısmını hedef proteini üretmeye yönlendirir.²⁷
• Metabolik Mühendislik: Bazen bir hücrenin doğal metabolizması, hedef protein üretimiyle rekabet edebilir. Sentetik biyoloji araçları (örn. gen “knockout”ları ²⁹ veya CRISPR/Cas sistemleri ³⁰), istenmeyen metabolik yolları kapatmak ve tüm hücresel kaynakları (örn. karbon akışı) hedef protein sentezine yönlendirmek için kullanılabilir.²⁹ Örneğin, kazeinden biyoaktif peptitlerin üretimini artırmak için Laktik Asit Bakterilerinin (LAB) proteolitik sistemlerini (enzimlerini) modüle etmek için CRISPR-Cas araçları kullanılmaktadır.³¹

3.2 Bakteriyel Konak Sistemler (Prokaryotik)

Escherichia coli (E. coli):

Rekombinant protein üretiminin geleneksel “çalışma atı”dır (workhorse). Genetik mühendisliğinin doğuşundan (insülin 18) günümüze kadar en yaygın kullanılan sistem olmuştur.

• Avantajları: Son derece hızlı büyüme hızına sahiptir (bölünme süresi ~20 dakika), genetik araç setleri kapsamlı ve iyi anlaşılmıştır ⁹ ve besiyeri (kültür ortamı) gereksinimleri çok basit ve ucuzdur.³² İlk kazein ³⁴ ve $\beta$-laktoglobulin ³⁵ ekspresyon denemelerinin çoğu E. coli‘de yapılmıştır.
• Dezavantajları ve Sınırlılıkları: En büyük kısıtlaması, bir prokaryot (basit hücre yapısı) olmasıdır. Bu nedenle, karmaşık ökaryotik proteinlerin (memeli proteinleri gibi) gerektirdiği Post-Translasyonel Modifikasyonları (PTM) yapamaz.⁹ PTM’ler, bir protein sentezlendikten sonra ona eklenen kimyasal modifikasyonlardır ve proteinin doğru katlanması, stabilitesi ve işlevi için genellikle kritik öneme sahiptir.

• E. coli, proteinlere şeker grupları ekleyemez (glikozilasyon yapamaz).
• Daha da önemlisi, E. coli, Bölüm 5’te ayrıntılı olarak ele alınacağı gibi, kazeinin işlevselliği için hayati önem taşıyan fosforilasyonu gerçekleştirecek doğal bir mekanizmaya sahip değildir.³⁵
• Ayrıca, E. coli‘de yüksek seviyelerde yabancı protein ifade edildiğinde, bu proteinler hücre içinde yanlış katlanabilir ve “inkl ⁹]. Bu çözünmez protein yığınlarının daha sonra hücreden çıkarılması, çözündürülmesi ve yeniden katlanması (refolding) gerekir; bu da maliyetli ve verimsiz bir süreçtir.¹⁸

3.3 Maya Konak Sistemleri (Ökaryotik)

Maya sistemleri, bakteriyel sistemlerin PTM sınırlamalarını aşmak için tercih edilen ökaryotik (karmaşık hücre yapısı) konaklardır.³² Bakteriler gibi hızlı büyürler ancak memeli hücrelerine daha benzer PTM yetenekleri sunarlar.

Saccharomyces cerevisiae (Bira Mayası/Ekmek Mayası):

• Avantajları: Genetik araçları çok iyi bilinmektedir ve binlerce yıldır gıda üretiminde (bira, ekmek) kullanıldığı için FDA tarafından “Genel Olarak Güvenli Kabul Edilen” (GRAS) statüsüne sahiptir.³⁷ Bu, gıda uygulamaları için düzenleyici onay almayı kolaylaştırır.
• Dezavantajları: S. cerevisiae‘nin PTM mekanizması, memelilerinkinden farklıdır. Özellikle, proteinleri sıklıkla “hiperglikozile” eder; yani, proteinlere aşırı derecede uzun ve dallanmış mannoz (şeker) zincirleri ekler.²⁶ Bu durum, proteinin doğal yapısını bozabilir, çözünürlüğünü azaltabilir veya potansiyel olarak istenmeyen immünojenik (alerjik) reaksiyonlara neden olabilir.

Pichia pastoris (Yeni adıyla Komagataella phaffii):

Süt proteini de dahil olmak üzere rekombinant protein üretimi için en umut verici ve yaygın kullanılan maya konaklarından biri olarak öne çıkmaktadır.26

• Avantajları:

1. Yüksek Hücre Yoğunluğu: Biyoreaktörlerde son derece yüksek hücre yoğunluklarına (fermantasyon kültürünün neredeyse katı bir macun kıvamına gelmesi) ulaşabilir, bu da hacim başına çok yüksek ürün titresi anlamına gelir.²⁸
2. Güçlü İndüklenebilir Promotörler: En yaygın kullanılan sistemi, metanol ile aktive olan AOX1 promotörüdür. Bu sistem, hücreler istenen yoğunluğa ulaşana kadar normal şekilde büyümelerine izin verir ve ardından metanol eklendiğinde, hücrenin tüm protein üretim mekanizmasını hedef süt proteinini üretmeye “zorlar”.²⁸
3. Üstün Sekresyon (Salgılama): P. pastoris‘in en büyük avantajlarından biri, üretilen rekombinant proteinleri hücre dışındaki kültür ortamına (besiyeri) salgılama konusundaki yüksek verimliliğidir.²⁶ Bu, saflaştırma (Downstream Processing – DSP) adımını E. coli‘ye kıyasla devrimsel nitelikte basitleştirir. E. coli‘de olduğu gibi proteinleri çıkarmak için hücreleri parçalamak (ve tüm hücre içi bileşenlerden ayırmak) yerine, proteinler doğrudan sıvı besiyerinden “hasat” edilebilir.²⁶
4. Daha İyi PTM Yetenekleri: S. cerevisiae‘nin aksine, P. pastoris hiperglikozilasyon eğiliminde değildir ve memeli hücrelerine daha çok benzeyen (daha kısa, yüksek mannozlu) glikozilasyon kalıpları üretir.²⁶ Ayrıca, Bölüm 5’te tartışılacağı gibi, belirli kazein türlerini fosforile etme konusunda da doğal bir potansiyel göstermiştir.³⁸

• Diğer Mayalar: Kluyveromyces lactis ve Yarrowia lipolytica gibi “geleneksel olmayan” mayalar da, PTM ve salgılama avantajları nedeniyle süt proteini üretimi için aktif olarak araştırılmaktadır.³³

3.4 Tablo 1: Süt Proteini Sentezi için Başlıca Mikrobiyal Konak Sistemlerin Karşılaştırılması

Aşağıdaki tablo, bir araştırmacının belirli bir süt proteini (örn. basit bir peynir altı suyu proteini veya karmaşık bir kazein) üretimi için neden belirli bir konak sistemi seçeceğini özetleyen teknik bir karşılaştırma sunmaktadır.

BÖLÜM 4: “İLK DALGA” ÜRETİM: PEYNİR ALTI SUYU (WHEY) PROTEİNLERİ

Bilimsel ve ticari literatür, rekombinant süt ve yumurta proteinlerini “ilk dalga” (first wave) gıda devrimi ürünleri olarak tanımlamaktadır.² Bu “ilk dalga” tanımının merkezinde, teknik olarak üretimi en kolay olan protein grubu, yani peynir altı suyu (whey) proteinleri yer almaktadır.

Süt, temelde iki ana protein ailesinden oluşur: kazeinler (toplam proteinin ~%80’i) ve peynir altı suyu proteinleri (toplam proteinin ~%15-20’si).¹⁴ Peynir altı suyu proteinleri ailesi de kendi içinde $\beta$-laktoglobulin (BLG) ve $\alpha$-laktalbumin (ALA) olmak üzere iki ana bileşenden oluşur.¹⁴

Peynir altı suyu proteinlerinin “ilk dalga” olmasının temel nedeni, kazeinlerle karşılaştırıldığında yapısal basitlikleridir. Kazeinler, Bölüm 5’te ayrıntılı olarak inceleneceği gibi, karmaşık PTM’lere (fosforilasyon) ve supramoleküler (moleküller arası) birleşmelere (misel oluşumu) dayanan “doğal olarak düzensiz” (intrinsically disordered) proteinlerdir.¹⁵

Buna karşılık, $\beta$-laktoglobulin ve $\alpha$-laktalbumin gibi peynir altı suyu proteinleri, tipik “globüler” (küresel) proteinlerdir. Bu, amino asit zincirlerinin, kararlı, kompakt, üç boyutlu bir yapıya kendi başlarına (veya konak hücrenin genel katlanma mekanizmalarının yardımıyla) katlandığı anlamına gelir. Daha da önemlisi, bu proteinlerin birincil işlevleri (beslenme ve gıda dokusu) için kazeinlerinki kadar karmaşık ve spesifik PTM’lere veya misel gibi devasa yapılar oluşturmaya bağımlılıkları yoktur.

Bu yapısal basitlik, onları E. coli veya P. pastoris gibi standart mikrobiyal konak sistemlerinde üretmeyi teknik olarak çok daha kolay ve öngörülebilir hale getirir. Gen (örn. bovin BLG geni) konağa yerleştirilir, ifade edilir ve protein, doğal (native) proteinle büyük ölçüde aynı yapısal ve fonksiyonel özelliklere sahip olacak şekilde katlanır.⁴

Rekombinant peynir altı suyu proteinlerinin besinsel değeri, geleneksel sütten elde edilen muadilleriyle kimyasal olarak aynı olacak şekilde tasarlanmıştır. Süt proteinleri, beslenme açısından yüksek kaliteleriyle bilinirler. Özellikle, kas protein sentezini (MPS) tetiklemede kritik rol oynayan dallı zincirli amino asitler (BCAA) – lösin, izolösin ve valin – açısından zengindirler.⁴² Rekombinant üretim, bu proteinlerin, tüm esansiyel amino asitleri optimum oranlarda içeren tam (complete) proteinler olmasını sağlar.⁴³

Bu proteinlerin kalitesi genellikle PDCAAS (Protein Sindirilebilirliği Düzeltilmiş Amino Asit Skoru) ile ölçülür. PDCAAS, bir proteinin amino asit profilini ve insan sindirilebilirliğini ölçen bir standarttır; 1.0 mümkün olan en yüksek skordur. Rekombinant peynir altı suyu proteinleri, doğal muadilleri gibi 1.0 PDCAAS skoruna sahip olacak şekilde hedeflenir, bu da onları sporcu beslenmesi, klinik beslenme veya yaşlanan popülasyonlar için ideal, yüksek biyoyararlanımlı bir protein kaynağı yapar.⁴³ İnsanlar üzerinde yapılan bir çalışmada, (geleneksel) fermente edilmiş peynir altı suyunun, fermente edilmemiş konsantreye (WPC) kıyasla kas kütlesi gelişimini ve dinamik denge performansını artırmada daha etkili olduğu gösterilmiştir; bu da fermantasyonun sindirilebilirlik ve BCAA salınımı üzerindeki olumlu etkisini vurgulamaktadır.⁴² Rekombinant teknoloji, bu besinsel profili doğrudan hedefleme kapasitesi sunar.

Ayrıca, peynir altı suyunun (geleneksel peynir üretiminin bir yan ürünü olarak) kendisi, paradoksal bir şekilde, rekombinant proteinlerin üretimi için ucuz bir besiyeri (substrat) olarak da kullanılabilir.⁴⁵ Bu, biyoteknolojik bir döngüsel ekonomi yaklaşımıdır ⁴⁵, ancak bu, rekombinant süt proteininin kendisinin üretiminden ayrı bir süreçtir.

BÖLÜM 5: BÜYÜK ZORLUK (THE GRAND CHALLENGE): KAZEİN SENTEZİ VE MİSEL REKONSTRÜKSİYONU

Peynir altı suyu proteinlerinin (whey) üretimi, biyoteknolojik bir optimizasyon ve ölçeklendirme sorunu olsa da, “bakteri sütü”nün gerçek anlamda hayata geçirilmesi, süt proteinlerinin kalan %80’lik kısmını oluşturan kazeinlerin üretilmesine bağlıdır.¹⁴ Bu, sadece bir mühendislik sorunu değil, aynı zamanda temel biyokimya ve supramoleküler kimya alanlarında muazzam bir bilimsel zorluktur.

Sütü “süt” yapan özelliklerin çoğu – beyaz opak rengi ⁴⁷, karakteristik dokusu (mouthfeel), ısı stabilitesi ve peynir veya yoğurt haline gelebilme yeteneği ¹⁶ – kazeinlerden kaynaklanır. Ancak bu özellikler, dört ana kazein türünün ($\alpha_{s1}$-, $\alpha_{s2}$-, $\beta$- ve $\kappa$-kazein) ¹⁴ kendilerinden değil, bu proteinlerin kalsiyum fosfat ile bir araya gelerek oluşturdukları devasa kolloidal yapılar olan kazein misellerinden (casein micelles) kaynaklanır.¹⁵

Bu miselleri mikrobiyal sistemler kullanarak yeniden yaratma süreci, teknolojinin “kutsal kasesi” (holy grail) olarak kabul edilir ve iki ana zorluk seviyesi içerir:

1. Bireysel Kazeinlerin Sentezi: Proteinlerin kendilerini doğru biyokimyasal modifikasyonlarla (özellikle fosforilasyon) üretmek.
2. Misel Rekonstrüksiyonu: Bu bireysel proteinleri ve mineralleri, doğal misel yapısını oluşturacak şekilde in vitro olarak bir araya getirmek.

5.1 Kazeinin Biyokimyası: Fosforilasyonun Zorunlu Rolü

Peynir altı suyunun globüler proteinlerinin aksine, kazeinler “doğal olarak düzensiz” (intrinsically disordered) proteinler sınıfına aittir.¹⁵ Bu, sabit, katlanmış bir üç boyutlu yapıya sahip olmadıkları, bunun yerine esnek ve dinamik bir yapı sergiledikleri anlamına gelir.

Bu proteinlerin işlevselliği, birincil amino asit dizilerine değil, memeli süt bezinde (mammary gland) meydana gelen kritik bir Post-Translasyonel Modifikasyona (PTM) bağlıdır: fosforilasyon.¹⁵

Fosforilasyon, protein kinaz adı verilen spesifik enzimlerin, protein zincirindeki belirli serin (Ser) veya treonin (Thr) amino asit kalıntılarına bir fosfat grubu ($PO_4^{3-}$) eklediği biyokimyasal bir süreçtir. Doğal bovin $\alpha_{s1}$-kazein protein başına 8-9 fosfat grubu (SerP) taşırken, $\beta$-kazein yaklaşık 5 SerP taşır.¹⁶

Bu fosfat grupları, protein üzerinde yüksek oranda negatif yüklü bölgeler oluşturur. Üç veya daha fazla SerP kalıntısı bir araya geldiğinde, bunlar “fosfat merkezleri” (Phosphate Centers – PCs) olarak bilinen yapılar oluştururlar.¹⁶ Kazeinin temel biyolojik ve teknolojik işlevi, bu fosfat merkezleri aracılığıyla gerçekleşir: kalsiyum ($Ca^{2+}$) iyonlarını ve amorf kalsiyum fosfat nanokümelerini bağlamak ve stabilize etmek.¹⁶

Kazein miseli, esasen, binlerce kazein proteininin bu fosfat merkezleri aracılığıyla kalsiyum fosfat nanokümeleri etrafında toplandığı dev bir kalsiyum taşıma sistemidir. Bu yapı, sütteki kalsiyumun çökmesini (kireçlenmesini) engeller ve onu yeni doğan için biyolojik olarak kullanılabilir bir formda tutar.¹⁶

Bu biyokimyasal yapının gıda teknolojisindeki sonuçları kritiktir:

• Kalsiyum Bağlama: Fosforilasyon derecesi, kazeinin kalsiyum bağlama kapasitesiyle doğru orantılıdır.⁴⁹
• Jelleşme ve Pıhtılaşma: Fosforilasyon derecesi, asit (yoğurt yapımı) veya şirden enzimi (peynir yapımı) ile jelleşme ve pıhtılaşma özelliklerini doğrudan etkiler.¹⁶
• Stabilite: Misel stabilitesi, fosforilasyon derecesine bağlıdır.⁴⁹

Yapılan araştırmalar, fosforilasyonu kısmen veya tamamen giderilmiş (dephosphorylated) kazeinlerin misel oluşturamadığını ¹⁶, kalsiyum bağlama kapasitelerinin önemli ölçüde azaldığını ¹⁶ ve asit varlığında jelleşmek yerine (istenmeyen bir şekilde) çöktüğünü (precipitated) ⁴⁹ kesin olarak göstermiştir. Kısacası, fosforilasyon olmadan kazein, sütte işlev göremez.³⁵

5.2 Mikrobiyal Üretimdeki Engel: PTM Eksikliği

İşte “bakteri sütü”nün karşılaştığı temel biyokimyasal engel budur. Bölüm 3’te belirtildiği gibi, E. coli gibi bakteriyel sistemler, bu spesifik memeli tarzı fosforilasyonu gerçekleştirmek için gerekli enzimatik mekanizmalara sahip değildir.¹⁶

P. pastoris ve S. cerevisiae gibi mayalar ökaryotiktir ve kendi proteinlerini fosforile etmek için kinazlara sahiptirler (protein kinaz A yolu gibi).⁵⁰ Ancak, bu mayalar, memeli süt bezinde kazeinlerin spesifik fosforilasyonundan birincil olarak sorumlu olan Fam20C (Family with sequence similarity 20, member C) kinazına sahip değildir.¹⁶

Mayaların kendi içsel (endogenous) kinazları, kazein proteinlerini bir miktar fosforile edebilir ³⁶, ancak bu genellikle “rastgele”, spesifik olmayan bölgelerde ve doğal kazeinin gerektirdiği tam sayıda (örn. $\alpha_{s1}$ için 8-9 SerP) olmayan, düşük verimli bir fosforilasyondur. Bu, işlevsiz veya kısmen işlevsel proteinlere yol açar.

Ancak, bu alanda dikkate değer bir istisna rapor edilmiştir. Bir çalışma, P. pastoris‘te ifade edilen (L70S/P71S olarak modifiye edilmiş) bir bovin $\beta$-kazein varyantının, doğal bovin $\beta$-kazein ile aynı derecede fosforile edildiğini bulmuştur.¹ Bu, P. pastoris‘in kendi içsel kinazlarının, doğru koşullar altında ve belirli kazein substratları için, doğal fosforilasyon derecesini (tam olarak aynı bölgelerde olmasa bile) taklit etme potansiyeline sahip olabileceğini gösteren önemli bir bulgudur. Yine de bu, tüm kazein türleri için genelleştirilebilen bir çözüm değildir ve teknolojinin önündeki ana engel PTM eksikliği olmaya devam etmektedir.

5.3 Mühendislik Çözümleri: Fonksiyonel Kazein Üretme Stratejileri

Bu kritik PTM engelini aşmak için, sentetik biyoloji ve biyoteknoloji alanındaki araştırmacılar, birbirini dışlamayan üç ana strateji izlemektedir. Bu stratejiler, (A) sistemi biyolojik olarak kopyalamaktan (biyomimikri), (B) sistemi kimyasal olarak taklit etmeye (pragmatizm) ve (C) süreci in vitro olarak tamamlamaya kadar uzanır.

A. Biyomimikri: Kinaz Ko-Ekspresyonu (İn Vivo Fosforilasyon)

En zarif biyolojik çözüm, kazein proteinini üretecek geni ve onu fosforile edecek kinaz enziminin genini aynı anda mikrobiyal konağa yerleştirmektir (ko-ekspresyon).

• Mayada (Fam20C): Bu yaklaşım, memeli Fam20C kinaz geninin (veya kazein kinaz I veya II’nin) ⁴¹, $\alpha_{s1}$-, $\beta$- ve $\kappa$-kazein genleriyle birlikte P. pastoris veya Kluyveromyces lactis gibi bir maya konağının genomuna entegre edilmesini içerir.⁴¹ Teorik olarak bu, maya hücresinin kazeini ürettiği anda, aynı hücre içinde bulunan Fam20C kinazının da onu bularak doğal bölgelerinden fosforile etmesini sağlar.
• Bakteride (Bakteriyel Kinazlar): Yakın zamanda, E. coli‘nin PTM eksikliğini aşan önemli bir atılım rapor edilmiştir. Bir araştırma grubu, bovin $\alpha_{s1}$-kazeinini E. coli‘de, Bacillus subtilis adlı başka bir bakteriden alınan iki kinazla (PrkD ve YabT) birlikte ko-ifade etmiştir.¹⁶ Sonuçlar çığır açıcı olmuştur: in vitro ve in vivo deneyler, bu bakteri kinazlarının $\alpha_{s1}$-kazein üzerindeki dokuz doğal fosforilasyon bölgesinin tamamını (PrkD) veya sekizini (YabT) başarılı bir şekilde fosforile ettiğini ve doğal fosforilasyon desenini (phosphorylation pattern) yüksek doğrulukla kopyaladığını göstermiştir.¹⁶ Bu, E. coli gibi basit bir sistemin bile, doğru mühendislik yaklaşımıyla, fonksiyonel kazein üretmek için yeniden programlanabileceğini göstermiştir.

B. Pragmatizm: Fosfomimetik Mühendislik

Bu strateji, fosforilasyonun biyokimyasal sürecini değil, biyokimyasal sonucunu (yani negatif yükü) taklit etmeyi amaçlar.

• Yöntem: Kazein geninin kendisi üzerinde genetik mühendisliği yapılır. Fosforilasyonun normalde gerçekleştiği serin (Ser) veya treonin (Thr) amino asitlerini kodlayan DNA dizileri (kodonlar), doğal olarak negatif yüklü olan aspartat (Asp) veya glutamat (Glu) amino asitlerini kodlayan kodonlarla kalıcı olarak değiştirilir.⁴
• Avantajı: Bu, proteinin, üretildiği anda kalıcı olarak “fosforile edilmiş gibi” davranmasını sağlar. Bu “fosfomimetik” (phosphomimetic) protein, kinaz ko-ekspresyonu ihtiyacını tamamen ortadan kaldırır.⁴¹ Bu, üretim sürecini büyük ölçüde basitleştirir, maliyeti düşürür ve E. coli gibi PTM yapamayan basit konakların kullanımına olanak tanır.⁴
• Dezavantajı: Bu bir taklittir. Fosfat grubunun ($PO_4^{3-}$) negatif yükü, aspartatın yükünden farklıdır ve pH’a bağlı olarak farklı davranabilir. Bu taklit proteinin, doğal fosforile kazeinin kalsiyum bağlama dinamiklerini ve misel oluşturma kinetiğini tam olarak kopyalayıp kopyalayamayacağı, Bölüm 5.4’te tartışılacağı üzere aktif bir araştırma konusudur.¹⁶

C. İn Vitro Enzimatik Fosforilasyon

Üçüncü strateji, sorunu hücrenin dışına taşımaktır.

• Yöntem: Kazein, mikrop içinde (örn. E. coli‘de) fosforile edilmemiş (unphosphorylated) olarak, yüksek titrelerde üretilir ve saflaştırılır. Daha sonra, saflaştırılmış bu proteine, biyoreaktör dışında (in vitro) Kazein Kinaz II (CKII) gibi ⁵³ saflaştırılmış kinaz enzimleri eklenir. Bu enzimatik reaksiyon, proteinleri dışarıda fosforile eder.
• Dezavantajı: Bu yaklaşım, üretim sürecine (biyoreaktör, saflaştırma) ek olarak pahalı ve karmaşık bir enzimatik işlem adımı daha ekler. Gıda endüstrisinin hedeflediği $>50 \text{ g/L}$ titresi ve düşük maliyet hedefleri göz önüne alındığında, bu strateji farmasötik uygulamalar için uygun olsa da, gıda emtiaları için ekonomik olarak sürdürülebilir olmayabilir.¹⁶

5.4 Nihai Hedef: Kazein Misel Rekonstrüksiyonu

Yukarıdaki stratejilerden biri (veya bir kombinasyonu) kullanılarak fonksiyonel, fosforile (veya fosfomimetik) dört tip kazein proteininin tamamı saf toz halinde üretilse bile, “süt” elde edilmiş olmaz. Savaşın sadece yarısı kazanılmıştır.

Nihai hedef, bu saflaştırılmış mikrobiyal proteinleri, kalsiyum ve fosfat mineralleriyle doğru oranlarda bir araya getirerek, doğal sütte bulunan 50-300 nm boyutundaki o karmaşık kolloidal kazein misellerini in vitro olarak yeniden “inşa etmek”tir (reconstruct).⁴⁷

Bu, teknolojinin mevcut bilimsel sınırıdır (state-of-the-art) ve temel bir zorluktur. Araştırmacılar, bu misellerin tam iç yapısı (sub-micelle modelleri vs.) hakkında hala aktif olarak tartıştıklarını ve yapıyı “kimsenin gerçekten bilmediğini” belirtmektedir.⁴⁷

Araştırmacılar, bu karmaşık yapıyı ve kalsiyumun misel bütünlüğündeki rolünü anlamak için geleneksel biyokimyanın ötesine geçerek, Küçük Açılı Nötron Saçılımı (SANS) gibi ileri düzey fiziksel analiz tekniklerini kullanmaktadır.⁴⁷ SANS, araştırmacıların miselleri parçalamasına, yeniden oluşturmasına ve bu süreçte yapının nasıl değiştiğini nanoskalada gözlemlemesine olanak tanır.⁴⁷

Bu misel rekonstrüksiyonu, sadece akademik bir merak değildir; ürünün fonksiyonelliği için kritiktir:

1. Doku ve Ağız Hissi: Birçok bitki bazlı süt alternatifine kalsiyum eklendiğinde ortaya çıkan “kumlu” (gritty) doku ⁴⁷, kalsiyumun çözünmemesi veya çökmesinden kaynaklanır. Kazein miseli, kalsiyumu doğal olarak askıda tutan (sekestre eden) bir sistemdir. Başarılı bir rekombinant süt, bu pürüzsüz doku ve kalsiyum dağıtım sorununu çözmelidir.
2. Renk: Sütün beyaz opak rengi, bu 50-300 nm boyutundaki misellerin görünür ışığı saçmasından kaynaklanır.⁴⁷ Misel olmadan, çözelti yarı saydam olur.
3. Kalsiyum Dağıtımı: Misel, kalsiyum için bir “dağıtım sistemi” (delivery system) olarak işlev görür.⁴⁷

Yakın zamanda E. coli‘de üretilen fosforile ve fosfomimetik $\alpha_{s1}$-kazein üzerine yapılan atılım niteliğindeki çalışma ¹⁶, bu yeni proteinlerin doğal proteinle karşılaştırılabilir kalsiyum bağlama kapasitesi gösterdiğini bulmuştur. Bu, stratejinin işe yaradığını gösteren güçlü bir kanıttır. Ancak aynı çalışma, bu proteinlerin stabil nanokümeler ve tam miseller oluşturup oluşturamayacağının “daha fazla doğrulamaya ihtiyaç duyan açık bir soru” (an open question, requiring further validation) olduğunu da dürüstçe kabul etmektedir.¹⁶

5.5 Tablo 2: Rekombinant Kazein Fosforilasyonu için Mühendislik Stratejileri

Aşağıdaki tablo, kazein üretimindeki temel biyokimyasal zorluk olan fosforilasyonun üstesinden gelmek için mevcut bilimsel stratejileri özetlemektedir.

BÖLÜM 6: ÜRETİM SONRASI İŞLEMLER (DOWNSTREAM PROCESSING – DSP): SAFLAŞTIRMA VE FORMÜLASYON ZORLUKLARI

Hedeflenen süt proteinleri (görece basit peynir altı suyu veya karmaşık fosforile kazeinler), biyoreaktörde $>50 \text{ g/L}$ ² hedef titresiyle başarılı bir şekilde üretilse bile, süreç tamamlanmış sayılmaz. Bu proteinler, “fermantasyon çorbası” (fermentation broth) olarak bilinen karmaşık bir sıvı içinde, ölü hücreler, besiyeri bileşenleri, metabolik yan ürünler ve konak hücrenin salgıladığı diğer istenmeyen protein ve moleküllerle birlikte bulunur.

Bu proteinleri izole etmek, saflaştırmak ve gıda sınıfı bir bileşen haline getirmek için gereken adımlar bütününe “Üretim Sonrası İşlemler” veya Downstream Processing (DSP) denir. Farmasötik üretimde olduğu gibi, DSP, toplam üretim maliyetinin çok önemli bir kısmını (bazen %50’den fazlasını) oluşturabilir.⁵⁴ Gıda endüstrisinin düşük maliyet hedefleri göz önüne alındığında, DSP’nin verimliliği ve maliyeti, teknolojinin ekonomik fizibilitesi için en az biyolojik üretim (upstream) kadar kritiktir.

DSP süreci genel olarak üç aşamada incelenir ²³:

1. Ekstraksiyon (Ürün Yakalama): Hedef proteinin hücrelerden (eğer salgılanmadıysa, örn. E. coli‘deki inklüzyon cisimcikleri) veya kültür sıvısından (eğer salgılandıysa, örn. P. pastoris) ilk olarak ayrılması. Santrifüj veya mikrofiltrasyon gibi teknikleri içerir.
2. Saflaştırma: İstenmeyen safsızlıkların (diğer proteinler, DNA, polisakkaritler) giderilmesi. Genellikle kromatografi ⁵⁵ veya ultrafiltrasyon (UF) ²³ gibi membran tekniklerini kullanır.
3. Polishing ve Konsantrasyon: Ürünün son saflık seviyesine getirilmesi, konsantre edilmesi ve son formülasyona (örn. toz) dönüştürülmesi.²³

6.1 Spesifik Bir DSP Zorluğu: Maya Kaynaklı “Mannan Girişimi” (Mannan Interference)

Bölüm 3.3’te P. pastoris (yeni adıyla K. phaffii) mayasının, proteinleri yüksek verimlilikle hücre dışına salgılama (secretion) yeteneğinin büyük bir avantaj olduğu belirtilmişti. Bu, proteinleri hücre parçacıklarından ayırma ihtiyacını ortadan kaldırarak DSP’nin ilk adımını basitleştirir.

Ancak bu avantaj, “sistemik bir ödünleşmeyi” (systemic trade-off) de beraberinde getirir. P. pastoris, hedef süt proteinleriyle birlikte, hücre duvarı bileşenleri olan mannan (veya mannoproteinler) adı verilen yüksek moleküler ağırlıklı polisakkaritleri (şeker polimerleri) de yüksek miktarlarda hücre dışı ortama salgılar.⁵⁴

Bu durum, DSP’de ciddi bir zorluk yaratır. Bir çalışma, K. phaffii‘den salgılanan rekombinant $\beta$-laktoglobulin (rBLG), $\alpha_{s1}$-kazein (rCSN) ve laktoferrin (rLTF) proteinlerini incelemiştir. Hangi protein üretilirse üretilsin, kültür sıvısındaki ana safsızlığın (kuru bazda %52-66’sını oluşturan) mannanlar olduğu tespit edilmiştir.⁵⁴

Temel Sorun: Bu mannan safsızlıklarının moleküler ağırlık aralığının ($2 \text{ kDa}$ ila $242 \text{ kDa}$) ⁵⁴, hedef süt proteinlerinin moleküler ağırlık aralığıyla (örn. $\beta$-laktoglobulin ~18 kDa, kazeinler ~20-25 kDa) çakışmasıdır.

Teknik Sonuç: Proteinleri safsızlıklardan ayırmak için en yaygın ve ucuz gıda endüstrisi tekniklerinden biri olan boyuta dayalı membran ayrımı (örn. Ultrafiltrasyon) bu senaryoda “etkisiz” (ineffective) hale gelir.⁵⁴ Membran, benzer boyuttaki proteini ve mannanı ayırt edemez.

Bu “mannan girişimi”ni çözmek için alternatif saflaştırma yöntemleri (kromatografi gibi) gereklidir, ancak bunların da kendi sorunları vardır ⁵⁴:

1. Anyon Değişim Kromatografisi (AEX): Bu, yüke dayalı bir ayırma tekniğidir. Mannanı etkili bir şekilde giderir ve protein saflığını %20-41’den %64-81’e çıkarır. Ancak, bu süreçte proteinin büyük bir kısmı kaybedilir; geri kazanım oranı sadece %32-37’dir. Bu kadar düşük bir verim, gıda endüstrisinin düşük maliyet hedefleri için kabul edilemez.
2. İzolelektrik Nokta (IEP) Çöktürmesi: Proteinlerin belirli bir pH değerinde (IEP) çözünmez hale gelip çökmesi prensibine dayanır. Bu yöntem, rekombinant kazein (rCSN) için iyi çalışmış, %77 saflık ve yüksek geri kazanım sağlamıştır. Ancak, $\beta$-laktoglobulin veya laktoferrin için işe yaramamıştır.

Bu bulgular, DSP’nin ve özellikle P. pastoris gibi yüksek verimli konak sistemlerinin getirdiği spesifik safsızlık sorunlarının (mannan gibi), teknolojinin ekonomik fizibilitesi için kritik bir araştırma alanı olduğunu göstermektedir. Gelecekteki çalışmaların, mannanı daha verimli ve ucuz bir şekilde giderecek yeni saflaştırma stratejilerine odaklanması gerekmektedir.⁵⁴

6.2 “Nihai Engel”: Duyusal Özellikler (Sensory Properties)

Teknolojinin karşılaştığı son ve belki de en zorlu engel, biyoreaktör veya saflaştırma tankında değil, tüketicinin algısındadır. Teknik olarak mükemmel, %100 saf, fosforile ve misel yapısında rekombinant süt proteinleri üretilse bile, bu ürünlerin tadının “temiz” veya “süt gibi” olacağı garanti değildir.

Gıda biliminde yaygın olan bir yanılgı, süt proteinlerinin (kazein ve peynir altı suyu) tek başlarına hoş bir tada sahip olduğudur. Araştırmalar, tam tersinin doğru olabileceğini göstermektedir. Doğal (native) süt proteinlerinin kendileri, özellikle konsantre edildiklerinde (protein tozlarında olduğu gibi), bir dizi istenmeyen duyusal özelliğe sahiptir.⁵⁷

• Kazein Duyusal Profili: Doğal kazein ve kazeinatlardan elde edilen bulgular, bu proteinlerin “sülfür, hayvansı (animal), tortilla, küflü (musty), karton (cardboard), yanık tüy, tutkal ve acı tat” gibi “nispeten yoğun ve hoş olmayan tatlar” ile ilişkilendirildiğini göstermiştir.⁵⁷
• Peynir Altı Suyu (Whey) Duyusal Profili: Peynir altı suyu proteinleri, sülfür içeren amino asitler (metiyonin, sistein) açısından zengindir. Isıl işlem gördüklerinde (örn. pastörizasyon veya UHT), bu proteinler denatüre olabilir ve bu sülfür bileşikleri serbest kalarak “sülfürlü (sulphurous) ve yumurtamsı (eggy) aromalar” yaratabilir.⁵⁷ Peynir altı suyu protein hidrolizatları (WPH), proteoliz sırasında açığa çıkan hidrofobik peptitler nedeniyle sıklıkla “acı” (bitter) olarak tanımlanır.⁵⁷
• Doku (Mouthfeel): Protein içeriği arttıkça, algılanan “sıkılık/burukluk” (astringency) da artar.⁵⁷

Bu bulgular, rekombinant proteinler için kritik bir noktayı aydınlatmaktadır: Sütün hoş, kremamsı ve hafif tatlı tadı, sadece proteinlerden kaynaklanmaz. Bu tat, proteinlerin, yağ globüllerinin ⁶², laktozun (süt şekeri) ve minerallerin oluşturduğu karmaşık bir matris etkileşiminin sonucudur.

Rekombinant protein üretimi, bu proteinleri doğal “kötü tatlarını” (off-flavors) maskeleyen bu karmaşık gıda matrisinden ayırır. Saf rekombinant proteinler üretildiğinde, bu proteinlerin içsel (intrinsic), hoş olmayan duyusal profilleri açığa çıkar.

Bu nedenle, “bakteri sütü” üretimindeki nihai zorluk, sadece proteinleri üretmek değil, aynı zamanda bu proteinleri (örneğin bitkisel bazlı) yağlar, tatlandırıcılar (laktoz yerine) ve minerallerle birleştirerek, bu “kötü tatları” maskeleyecek ve sütün ağız hissini (mouthfeel) yeniden yaratacak bir formülasyon bilimine odaklanmaktır.¹² Rekombinant proteinin başarısı, biyoteknoloji kadar gıda formülasyonuna da bağlıdır.

BÖLÜM 7: SONUÇ VE GELECEKTEKİ ARAŞTIRMA YÖNELİMLERİ

Bu teknik inceleme, “bakteri sütü” olarak bilinen, yani hayvansal olmayan “gerçek” süt proteinlerinin (kazein ve peynir altı suyu) mikrobiyal sistemler (bakteri ve maya) aracılığıyla üretilmesinin arkasındaki karmaşık bilimsel ve teknolojik altyapıyı analiz etmiştir.

Analiz, bu teknolojinin, farmasötik alanda (örn. rekombinant insülin) ¹⁸ ve gıda enzimi üretiminde (örn. kimozin) ²² on yıllardır kanıtlanmış bir teknoloji olan hassas fermantasyona dayandığını ortaya koymaktadır. Ancak, bu teknolojinin süt proteinleri gibi düşük maliyetli, yüksek hacimli gıda emtialarına uygulanması, farmasötik üretime kıyasla temelde farklı ve çok daha zorlu bir dizi ekonomik ve teknik engeli beraberinde getirmektedir.

Temel zorluk, farmasötik üretimde gerekenden “birkaç kat büyüklükte” daha yüksek ² olan, ekonomik fizibilite için hedeflenen $>50 \text{ g/L}$ üretim titresi ² gereksinimidir. Bu hedef, araştırmanın odağını “suş mühendisliği”, “proses optimizasyonu” ve “ölçeklendirmeye” ² kaydırmıştır.

Rapor, rekombinant süt proteinleri üretimini iki ana zorluk seviyesine ayırmıştır:

1. “İlk Dalga” (Peynir Altı Suyu Proteinleri): $\beta$-laktoglobulin gibi yapısal olarak basit, globüler proteinlerin üretimi, teknik olarak büyük ölçüde çözülmüştür.⁴ Bu proteinler, kritik PTM’lere veya karmaşık birleşmelere ihtiyaç duymazlar. Buradaki temel zorluk artık temel bilim değil, maliyet, ölçeklendirme ve DSP verimliliği (örn. P. pastoris kaynaklı mannan safsızlıklarının giderilmesi ⁵⁴) gibi mühendislik sorunlarıdır.
2. “Büyük Zorluk” (Kazein ve Misel Rekonstrüksiyonu): Sütün fonksiyonel omurgasını oluşturan kazeinlerin üretimi, hala temel bilimsel zorlukların olduğu bir alandır. Temel engel, kazeinin kalsiyum bağlama ⁴⁹ ve jelleşme ⁴⁹ işlevleri için zorunlu olan fosforilasyonun ¹⁶, standart mikrobiyal konaklarda (özellikle memeli kinazı Fam20C’nin eksikliği nedeniyle ³⁶) kopyalanamamasıdır.

Bu inceleme, bu “büyük zorluk”un üstesinden gelmek için aktif olarak araştırılan en son mühendislik stratejilerini vurgulamıştır:

• Kinazların (bakteriyel PrkD/YabT ¹⁶ veya memeli Fam20C ⁴¹) kazeinlerle birlikte ko-ifade edildiği biyomimikri yaklaşımları.
• Fosforilasyonun negatif yükünü (Ser$\rightarrow$Asp) genetik olarak taklit eden fosfomimetik mühendislik.⁴

Ancak, fonksiyonel kazein proteinleri üretilse bile, nihai zorluğun, yani bu proteinlerin ve minerallerin, sütün dokusunu ve rengini veren kazein misel yapısını ⁴⁷ oluşturmak üzere in vitro olarak yeniden birleştirilmesi (rekonstrüksiyon) olduğu açıktır. SANS gibi ileri düzey tekniklerin ⁴⁷ kullanıldığı bu alan, gıda biliminin aktif sınırını temsil etmektedir ve tam olarak çözülmüş bir sorun değildir.¹⁶

Gelecekteki Araştırma Yönelimleri

Bu teknolojinin, geleneksel hayvancılık sistemlerini “tamamen sekteye uğratma” (disrupt) ² potansiyelini gerçekleştirmesi, aşağıdaki multidisipliner araştırma alanlarındaki ilerlemelere bağlıdır:

1. Biyoreaktör ve Ölçeklendirme Mühendisliği: Laboratuvardan pilot ve endüstriyel ölçeğe geçiş, yüksek hücre yoğunluklu kültürlerde steril koşulların korunması ⁵⁹, yeterli oksijen transferinin sağlanması, karıştırma (viskoz kültürlerde hücrelere zarar vermeden) ve açığa çıkan metabolik ısının (aşırı ısınmayı önleyerek) verimli bir şekilde yönetilmesi ⁵⁹ gibi kritik proses mühendisliği zorluklarını içermektedir.
2. Supramoleküler Kimya ve Misel Rekonstrüksiyonu: Fonksiyonel kazein proteinlerinin (mikrobiyal veya fosfomimetik) kalsiyum fosfat ile nasıl etkileşime girdiğini ve stabil, gıda sınıfı misel yapılarını oluşturmak için nasıl yönlendirilebileceğini anlamak.¹⁶
3. DSP Optimizasyonu: Özellikle P. pastoris sistemlerinde, protein verimini düşürmeden mannan gibi maliyetli safsızlıkları ⁵⁴ giderecek düşük maliyetli, yüksek verimli ve gıda sınıfı saflaştırma teknolojilerinin geliştirilmesi.
4. Duyusal Bilim ve Formülasyon: Saf rekombinant proteinlerin (hem kazein hem de peynir altı suyu) içsel “kötü tatlarını” (off-flavors) ⁵⁷ maskeleyen ve sütün ağız hissini (yağ emülsiyonları ile) yeniden yaratan karmaşık gıda matrislerinin tasarlanması.¹²

Sonuç olarak, “bakteri sütü”nün üretimi, insülin sentezinden çok daha karmaşık bir hedefi temsil etmektedir. Bu, sadece bir proteini üretmek değil, bir gıda sisteminin (süt) hem besinsel hem de fonksiyonel karmaşıklığını moleküler düzeyde yeniden inşa etme girişimidir. Başarı, biyoteknoloji, proses mühendisliği ve gıda kimyasının derin bir entegrasyonunu gerektirecektir.

Alıntılanan çalışmalar

1. Precision Fermentation as an Alternative to Animal Protein, a Review – MDPI, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://www.mdpi.com/2311-5637/10/6/315
2. The Next Food Revolution Is Here: Recombinant Microbial Production of Milk and Egg Proteins by Precision Fermentation – PubMed, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38134386/
3. The Next Food Revolution Is Here: Recombinant Microbial …, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://www.annualreviews.org/content/journals/10.1146/annurev-food-072023-034256
4. Precision fermentation of milk proteins – Welcome to DTU Research Database, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://orbit.dtu.dk/en/publications/precision-fermentation-of-milk-proteins
5. Cellular Agriculture: Techniques and Applications – Technology Networks, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://www.technologynetworks.com/cell-science/articles/cellular-agriculture-techniques-and-applications-400500
6. Full article: Dairy 3.0: cellular agriculture and the future of milk, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/15528014.2021.1888411
7. Dairy 3.0: cellular agriculture and the future of milk – ResearchGate, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://www.researchgate.net/publication/354995855_Dairy_30_cellular_agriculture_and_the_future_of_milk
8. A Planetary Health Approach to the Labeling of Plant-Based Meat – Food and Drug Law Institute, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://www.fdli.org/wp-content/uploads/2020/12/6-Negowetti-Final.pdf
9. The Next Food Revolution Is Here: Recombinant … – Annual Reviews, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://www.annualreviews.org/doi/pdf/10.1146/annurev-food-072023-034256
10. Livestock Farmers’ Attitudes towards Alternative Proteins – MDPI, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://www.mdpi.com/2071-1050/15/12/9253
11. A Rapid Evidence Review on Consumer Responses to Precision Fermentation, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://science.food.gov.uk/article/136898-a-rapid-evidence-review-on-consumer-responses-to-precision-fermentation
12. Dairy, Plant, and Novel Proteins: Scientific and Technological Aspects – PMC, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC11011482/
13. Framing the futures of animal-free dairy: Using focus groups to explore early-adopter perceptions of the precision fermentation process, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC9574361/
14. Can recombinant milk proteins replace those produced by animals? – ResearchGate, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://www.researchgate.net/publication/358258477_Can_recombinant_milk_proteins_replace_those_produced_by_animals
15. Caseins: Versatility of Their Micellar Organization in Relation to the Functional and Nutritional Properties of Milk – PMC – PubMed Central, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC10004547/
16. (PDF) Production of phosphorylated and functional αs1-casein in …, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://www.researchgate.net/publication/393325687_Production_of_phosphorylated_and_functional_as1-casein_in_Escherichia_coli
17. Genetic engineering – Wikipedia, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://en.wikipedia.org/wiki/Genetic_engineering
18. Cell factories for insulin production – PMC, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC4203937/
19. Dairy, Plant, and Novel Proteins: Scientific and Technological Aspects – MDPI, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://www.mdpi.com/2304-8158/13/7/1010
20. A brief history of fermentation and precision fermentation – Verley Food, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://verley-food.com/a-brief-history-of-fermentation-and-precision-fermentation/
21. History of Precision Fermentation | RethinkX, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://www.rethinkx.com/food-and-agriculture/in-depth/precision-fermentation/history
22. Precision Fermentation: Past, Present, and Future Promise | FoodUnfolded, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://www.foodunfolded.com/article/precision-fermentation-past-present-and-future-promise
23. Evolving Paradigms of Recombinant Protein Production in Pharmaceutical Industry: A Rigorous Review – MDPI, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://www.mdpi.com/2413-4155/6/1/9
24. Transgenic milk as a method for the production of recombinant antibodies – PubMed Central, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC7125573/
25. Recombinant DNA Technology | Springer Nature Experiments, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://experiments.springernature.com/articles/10.1007/978-1-0716-1818-9_2
26. Pichia pastoris: A highly successful expression system for optimal synthesis of heterologous proteins – PubMed Central, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC7228273/
27. Engineering Saccharomyces cerevisiae for efficient production of recombinant proteins – PMC – PubMed Central, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC11611019/
28. Advances in Metabolic Engineering of Pichia pastoris Strains as Powerful Cell Factories, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://www.mdpi.com/2309-608X/9/10/1027
29. Key Technologies of Synthetic Biology in Industrial Microbiology – PMC – PubMed Central, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC12566113/
30. Yeast synthetic biology for the production of recombinant therapeutic proteins – Oxford Academic, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://academic.oup.com/femsyr/article/15/1/1/542829
31. Unlocking Casein Bioactivity: Lactic Acid Bacteria and Molecular …, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC12427928/
32. Why is Yeast Important for Recombinant Protein Expression – GenScript, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://www.genscript.com/protein-news/why-is-yeast-important-for-recombinant-protein-expression.html
33. Comparison of Yeasts as Hosts for Recombinant Protein Production – PMC – NIH, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC6027275/
34. Recombinant expression analysis of natural and synthetic bovine alpha-casein in Escherichia coli – ResearchGate, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://www.researchgate.net/publication/12198333_Recombinant_expression_analysis_of_natural_and_synthetic_bovine_alpha-casein_in_Escherichia_coli
35. Challenges and potentials of recombinant milk protein, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://orbit.dtu.dk/files/387538713/Ph.D._Thesis_Arrate.pdf
36. Heterologous Caseins: The Role of Phosphorylation in Their … – MDPI, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://www.mdpi.com/2218-273X/15/7/1031
37. Yeast synthetic biology for the production of recombinant therapeutic proteins, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://academic.oup.com/femsyr/article-pdf/15/1/1/10745568/12195.pdf
38. Heterologous Caseins: The Role of Phosphorylation in Their Functionality and How to Achieve It – PubMed Central, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC12292773/
39. Production of Recombinant Proteins with Pichia pastoris in Integrated Processing | Request PDF – ResearchGate, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://www.researchgate.net/publication/230151041_Production_of_Recombinant_Proteins_with_Pichia_pastoris_in_Integrated_Processing
40. Expression and purification of glycosylated bovine beta-casein …, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11308323/
41. EP4122950A1 – Recombinant host cells and methods for producing …, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://patents.google.com/patent/EP4122950A1/en
42. A systematic review of health promoting effects of consumption of whey-based fermented products on adults – NIH, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC12405291/
43. Nutritional benefits of precision fermentation proteins – Verley Food, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://verley-food.com/nutritional-benefits-of-precision-fermentation-proteins/
44. A systematic review of health promoting effects of consumption of whey-based fermented products on adults – Frontiers, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://www.frontiersin.org/journals/nutrition/articles/10.3389/fnut.2025.1651365/full
45. Recent Biotechnological Applications of Whey: Review and Perspectives – MDPI, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://www.mdpi.com/2311-5637/11/4/217
46. The Role of Whey in Functional Microorganism Growth and Metabolite Generation: A Biotechnological Perspective – PubMed Central, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC12071764/
47. ISIS Microbes may offer a sustainable alternative to dairy, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://www.isis.stfc.ac.uk/Pages/Microbes-may-offer-a-sustainable-alternative-to-dairy-.aspx
48. Production of phosphorylated and functional αs1-casein in Escherichia coli – PubMed, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40610262/
49. Unravelling the dominant role of phosphorylation degree in …, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://orbit.dtu.dk/files/380412103/1-s2.0-S0268005X24008890-main.pdf
50. Regulation of yeast central metabolism by enzyme phosphorylation – EMBO Press, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://www.embopress.org/doi/10.1038/msb.2012.55
51. Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae | Microbiology and Molecular Biology Reviews – ASM Journals, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://journals.asm.org/doi/abs/10.1128/mmbr.64.1.34-50.2000
52. Flux control through protein phosphorylation in yeast – PubMed, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27797916/
53. Regulation of in vitro phosphorylation of the casein kinase II sites in B-50 (GAP-43), erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/9507176/
54. Mannan interference and purification efficiency in downstream …, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://research-portal.uu.nl/en/publications/mannan-interference-and-purification-efficiency-in-downstream-pro/
55. (PDF) Extraction and purification methods in downstream processing of plant-based recombinant proteins – ResearchGate, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://www.researchgate.net/publication/288918981_Extraction_and_purification_methods_in_downstream_processing_of_plant-based_recombinant_proteins
56. Current status and challenges for cell-cultured milk technology: a systematic review – PMC, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC11161985/
57. Sensory Properties of Dairy Proteins | Request PDF – ResearchGate, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://www.researchgate.net/publication/283399863_Sensory_Properties_of_Dairy_Proteins
58. Effect of Whey Protein Changes on Milk Flavor and Sensory Characteristics During Heating, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://www.mdpi.com/2304-8158/14/1/33
59. How precision fermentation can advance sustainable dairy – GEA, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://www.gea.com/en/stories/how-precision-fermentation-can-advance-sustainable-dairy/
60. Confidently scaling-up microbial fermentation: Overcoming common challenges, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://infors-ht.com/en/blog/confidently-scaling-up-microbial-fermentation-overcoming-common-challenges
61. Biotechnology Approaches to Dairy Alternatives Through Precision Fermentation and Cellular Agriculture – Food Science of Animal Resources, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://www.kosfaj.org/archive/view_article?pid=kosfa-45-5-1221
62. Investigations into the use of micellar casein for the manufacture of high protein cultured milk products, erişim tarihi Kasım 5, 2025, https://asset.library.wisc.edu/1711.dl/F2GDDFAWKSJPO8D/R/file-aec89.pdf